Prospecção de clones com atividade de lipase e esterase em biblioteca metagenômica de solo sob cultivo de cana-de-açúcar

Abstract

A biosfera é dominada pelos micro-organismos, que constituem 60% da biomassa total, e são responsáveis por ciclos biogeoquímicos vitais sem os quais a vida não seria possível. Assim, a compreensão da estrutura da comunidade microbiana, sua diversidade e função são essenciais para entendermos a evolução e a sustentabilidade da vida na Terra. Dentro deste contexto, o solo constitui-se um dos mais importantes habitats para micro-organismos, componentes essenciais da biota terrestre representando a maior diversidade genética e metabólica dentre as formas de vida existentes. Eles são extremamente diversos, tem inúmeras atividades metabólicas e produtos que podem ter aplicações industriais, no entanto, 99% não podem ser cultivados em condições comumente usadas em laboratório, deixando o seu potencial inexplorado. Em função dos problemas ambientais que enfrentamos atualmente, o aquecimento global, esgotabilidade de recursos não renováveis, é necessário que se desenvolvam tecnologias “limpas” que não irão agredir o meio ambiente. Sendo que uma forma de contribuir para sua manutenção é a produção de biocombustíveis que podem ser gerados a partir de fontes renováveis, vegetais, já que seu resíduo não agride a atmosfera como fazem os de origem fóssil. A metagenômica é uma metodologia que permite acessar genes de bactérias não cultiváveis, pois se baseia na análise genômica de uma comunidade de micro-organismos sem a necessidade de cultivo em laboratório. Esta abordagem tem sido utilizada com sucesso nos últimos anos para obter novos produtos a partir de microorganismos não cultiváveis provando ser uma poderosa ferramenta para a recuperação de novas biomoléculas, isolamento de enzimas e novas moléculas de importância industrial. Através desta metodologia pode-se produzir um catalisador enzimático biodegradável para a reação de produção do biodiesel (transesterificação). Assim, o objetivo deste trabalho foi prospectar enzimas lipolíticas de uma biblioteca metagenômica fosmidial de solo sob cultivo de cana-de-açúcar, de 4896 clones, visando uma possível aplicação na produção do biodiesel, no processo de transesterificação. A seleção foi feita pela atividade lipolítica através do cultivo dos clones em placa de Petri contendo o meio Luria-Bertani (LB) suplementado de 1% de tributirina (v/v), 1% de goma arábica (p/v), 0,00125% de cloranfenicol (v/v) e 0,001% arabinose (v/v). As células ficaram em cultivo a 37 ºC por 72 horas e depois foram transferidas para temperatura de 4 ºC por 7 dias. A avaliação foi realizada pela observação de um de halo ao redor da colônia, sendo positiva para 2 clones. Estes dois clones que apresentaram halos foram selecionados, e tiveram o seu DNA subclonado em vetor puC19. Os DNAs dos subclones foram sequenciados no ABI 3100 (Applied Biosystems), gerando um contig completo para cada subclone, que foram comparados com as sequências do banco Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI), através do ORF Finder. Foram encontradas 3 ORFs com possíveis genes codificadores de enzimas lipolíticas.

The biosphere is dominated by micro-organisms, which constitute 60% of the total biomass, and are responsible for vital biogeochemical cycles without which life would not be possible. Thus, understanding the microbial community structure, diversity and function are essential for understanding the evolution and sustainability of life on Earth. Within this context, the soil constitutes one of the most important habitats for microorganisms, essential components of most terrestrial biota representing metabolic and genetic diversity among life forms. They are extremely diverse, has a number of metabolic activities and products that may have industrial applications, however, 99% cannot be grown under conditions commonly used in the laboratory, leaving their potential untapped. Depending on the environmental problems we face today, global warming, depletion of nonrenewable resources, it is necessary to develop "clean" technologies that will not harm the environment. Since one way to contribute to its maintenance is the production of biofuels that can be generated from renewable sources, vegetables, since their waste does not harm the atmosphere as do the fossil. The metagenomics is a methodology that allows access to non-culturable bacterial genes because it is based on genomic analysis of a community of micro-organisms without the need to cultivate in the laboratory. This approach has been used successfully in recent years for new products from microorganisms not cultivable proving to be a powerful tool for recovery of new biomolecules, enzymes and isolation of new molecules of industrial importance. Through this methodology it is possible to produce a biodegradable enzyme catalyst for the reaction of biodiesel production (transesterification). The objective of this study was to prospect lipolytic enzymes from a library fosmidial metagenomics of soil under cultivation of cane sugar, clones 4896, aiming at a possible application in the production of biodiesel in the transesterification process. The selection was made by lipolytic activity by growing clones on Petri dishes containing Luria-Bertani medium (LB) supplemented 1% tributyrin (v / v), 1% gum arabic (w / v), 0, 00125% of chloramphenicol (v / v) arabinose and 0.001% (v / v). The cells were in culture at 37 ° C for 72 hours and then were transferred to 4 ° C for 7 days. The evaluation was performed by observing a halo around the colony, which was positive for two clones. These two clones that showed halos were selected and had their DNA subcloned into vector pUC19. The DNA from the subclones were sequenced on the ABI 3100 (Applied Biosystems), generating a complete contig for each subclone, which were compared with database sequences National Center for Biotechnology Information (NCBI), using the ORF Finder. We found three possible ORFs with genes encoding lipolytic enzymes.